一文带你了解光学显微镜的主要结构和工作原理

把东西放大并不难，难的是放大之后还能看清细节。这两个目标并不总是一致——把一张模糊的照片拉大，只会得到一张更大的模糊照片。显微镜的设计，很大程度上就是在与这个矛盾打交道。

它的成像分两步：物镜先把样品的细微结构分辨出来，形成一个中间像，再由目镜或相机把这个像放大。决定「能看多细」的是前一步，决定「看起来多大」的是后一步，两者的关键指标并不相同。

一、放大倍数大，不等于看得更清

设想样品上有两个靠得很近的点。如果物镜分辨能力不足，这两个点在中间像上就已经糊成了一个斑，后面无论怎么放大，都只能看到一个更大的斑——信息在第一步就已经丢了。

图1：倍数与分辨率不是一回事

真正决定细节的是分辨率，它由光的波长与物镜的收集能力共同决定：波长越短、收集角度越大，能分辨的两点间距就越小。把已经分辨出的细节放大才有意义，把模糊的像放大只得到更大的模糊。

选购时常被忽略三件事。有效放大倍数有上限：超过分辨率能支撑的倍数后再放大，不会有新信息出现。数值孔径比倍数更关键，它决定了能收集多少衍射光。照明也影响结果，照明方式不合适，再好的物镜也发挥不出来。

有效放大倍数有一个经验范围，大致是数值孔径的五百到一千倍。低于下限-时细节已经分辨出来却没被放大到肉眼可辨，高于上限则只是把模糊拉大。这也是为什么高倍观察常要配高数值孔径物镜——两者得匹配。

二、数值孔径是什么，为什么它关键

样品上每一点发出的光会向各个方向散开，物镜只能收进落在自己口径内的那一部分。收进来的光锥越宽，参与成像的衍射光越多，细节保留得越完整。

图2：数值孔径与收集角

这个收集能力用数值孔径来量，写作 NA = n·sinθ，其中 n 是物镜与样品之间介质的折射率，θ 是光锥的半角。半角越大、介质折射率越高，数值孔径就越大。

它与分辨率成反比：可分辨的最小间距约等于波长除以两倍数值孔径。因此数值孔径翻倍，可分辨间距就减半。

这里能看出浸液的作用：同样是那个角度，空气的 n 约为一点零，水约为一点三三，香柏油约为一点五二。所以油浸物镜能达到的数值孔径最高，看得也最细——这就是它存在的理由。

还有一个量常被写进规格书却容易被忽略：出瞳直径。它决定了从目镜出来的光束有多粗，也决定了眼睛在某个位置上能否看全整个视野。低倍物镜的出瞳通常较粗，观察起来舒适；高倍时出瞳变细，眼睛位置稍偏就会看到视野被切掉一块。

三、物镜为什么不只是一片透镜

单片透镜在高倍下撑不住：球差使边缘与中心的光线不聚于同一点，色差使不同波长的光聚焦在不同位置。结果是像既发虚又带彩边。

图3：多片组合与校正等级

实际物镜是多片透镜的组合，用不同形状、不同材料的镜片互相抵消像差。按校正程度分几档：消色差校正两种色差，日常够用、价格适中；复消色差校正三种色差，要求高时选用，价格明显更高；平场则校正场曲，拍平面图像时画面才平整。

镜筒上的标注都在说这几件事：放大倍数、数值孔径、工作距离（物镜前端到样品的距离，高倍时通常很短），以及盖玻片厚度——多数物镜按零点一七毫米设计，偏差会引入球差，高倍时尤其明显。

镜筒上还会标出建议的浸液类型。油浸物镜必须滴油才能发挥标称的数值孔径，干镜则绝不能沾油——沾了会改变前透镜的工作条件，像质立刻下降。用完及时清洁也是必要的，残留的油会干结并影响后续使用。

四、样品不染色时，靠什么产生对比

许多生物样品是近乎透明的，光直接穿过去，吸收很少，明场下几乎看不见。这时就得换照明方式。

图4：四种照明方式

明场让光直接透过样品，背景亮、样品暗，适合本身有颜色或经过染色的样品。暗场反过来，挡住直射光、只收集被样品散射的光，于是背景暗、边缘亮，适合看透明样品的轮廓。

相差更巧妙：透明样品不改变光的强度，但会改变光的相位。相差照明把这种相位差转换成亮度差，于是不用染色也能看清活细胞，代价是图像周围常出现光晕。

第四种是荧光：先用特定波长激发，再看样品自身发出的光。它的灵敏度高，原因有三——激发与发射波长不同可用滤光片分开；没有标记的地方不发荧光，背景极暗；而且可以让标记只结合目标结构，从而定位它在哪里。

还要留意两种副作用。光漂白：荧光分子在反复激发下会逐渐失去发光能力，因此长时间观察时信号会衰减，需要控制曝光强度与时间。光晕：相差成像中样品边缘常出现一圈亮环，那是相位转换过程中的固有产物，容易掩盖紧贴边缘的细小结构。

五、放大之后，还有哪些限制跟着来

倍数上去之后，两个限制会立刻变得明显。

景深——能同时看清的厚度。倍数越高，景深越薄，高倍下往往只有很薄一层是清晰的，其余都是模糊的。因此高倍观察常需要逐层调焦，或用软件把多层合成。

图5：景深与工作距离

工作距离随倍数迅速缩短：四倍物镜可能还有近二十毫米，二十倍降到几毫米，一百倍往往不足一毫米。高倍物镜几乎贴着样品，操作时稍不注意就会碰到，这一点在实际使用中要特别留意。

还有几个常见误区值得提前避开。以为倍数越高越好——超过分辨率支撑的范围只是把模糊放大。忽略盖玻片厚度——厚度不符会引入球差，高倍时尤其明显。油浸物镜用错油——折射率不匹配，标称的数值孔径实际达不到。照明没调好就怪物镜——聚光镜与光阑的设置同样决定成像质量。

至于相机一侧，有个匹配问题值得一提：相机的像素尺寸要与物镜的分辨能力相称。像素太粗会浪费已经分辨出的细节，像素过细则只是把同一个细节拆成更多像素，并不会带来更多信息——这与前面谈的放大倍数上限其实是同一个道理。

六、选物镜时要看哪些参数

选型时通常在这五个参数之间权衡。

放大倍数决定看到的视野大小，常用四倍到一百倍，油浸物镜多为六十倍以上。数值孔径紧跟在倍数后面标出，是分辨率的关键指标，干镜一般在零点一到零点九五，油浸可达一点四五。

图6：选物镜要看的参数

工作距离决定操作空间，随倍数升高而迅速缩短，高倍时不足一毫米——如果需要一边观察一边操作样品，这一项往往比倍数据更优先。

校正等级决定像质与价格，从消色差到复消色差，平场另计。浸液介质必须与物镜设计匹配，用错介质则标称的数值孔径无法达到。

还有一个实用细节：齐焦距离。同一系列的物镜通常设计成换倍后焦点基本不动，切换时只需微调即可重新看清。不同厂家、不同系列的物镜齐焦距离未必相同，混用时会明显不便，因此整套系统最好选用同一系列。

七、总结

显微镜的成像分两步：物镜先分辨出细节，目镜或相机再把它放大。决定「能看多细」的是前一步，关键指标是数值孔径；决定「看起来多大」的是后一步，指标是放大倍数。两者并不等价。

分辨率约等于波长除以两倍数值孔径，因此数值孔径比放大倍数更能说明一台显微镜的能力。

数值孔径等于介质折射率乘以光锥半角的正弦，油浸物镜靠高折射率介质获得更高的收集能力。

倍数升高会带来景深变薄与工作距离缩短，这两个限制往往比倍数本身更影响实际操作。

数值孔径与工作距离互相制约：追求高分辨率通常要接受很短的工作距离，而需要操作空间时又得在分辨率上让步。规格书上的数值孔径是在规定浸液介质与盖玻片厚度下测得的，实际使用时若这两项不符，标称值就达不到。

还要说明的是，显微镜给出的是样品在特定照明与处理方式下的像，它反映的是样品经过制备和标记之后的状态，与样品原本的样子之间隔着制备这一步——这一点在解读图像时值得单独考虑。